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新制造工艺提高CAR-NK细胞的疗效——IsoLight全自动单细胞功能蛋白质组学分析系统

时间:2022-02-24 来源:上海玮驰仪器有限公司 阅读:464

截至目前,超过5种CAR-T细胞治疗产品获得美国FDA认证,批准上市。国内首款CAR-T产品也已获批上市。但CAR-T产品也存在着生产周期长、有细胞因子风暴及神经毒性副作用等挑战。

 

CAR-NK细胞被认为可能应对这些挑战,其发展引起了研究人员的大兴趣——主要是因为相比传统的CAR-T细胞,CAR-NK细胞具有独特的优势。与CAR-T细胞不同,CAR-NK细胞可以应用于异体细胞治疗环境,这意味着它有潜力成为一种“现成的”治疗方法,并降低移植物抗宿主病(GVHD)的风险,解决了周期长,必须应对个体化需求的问题。CAR-NK细胞不像CAR-T细胞那样在体内长时间存活,从而降低了靶向正常细胞和非肿瘤细胞的风险。此外,由于NK细胞分泌的细胞因子相与T细胞不同,NK细胞造成细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性的风险较低。

 

更重要的是,CAR在NK细胞中的表达可以增加其固有的细胞杀伤能力,改善未修饰前NK细胞的治疗结果。已知未修饰的NK细胞临床前研究已经产生了很好的结果及安全性,但仍未转化为成功的临床实验,虽有多达50%的患者中产生了阳性反应,但其他实验报告的临床疗效还是有限。提示我们CAR修饰的NK细胞治疗可能是更好的治疗方案。

 

慢病毒NK细胞转染方案
 

限制CAR-NK细胞治疗发展的挑战之一是基因转染方式。逆转录病毒载体已被广泛研究,转染后在NK细胞中的效率约为27%-52%。以及转染后CAR-NK细胞活力低和突变的风险而受到限制。一种更安全的选择是用慢病毒(LV)转染,因为它提供了降低基因毒性和插入突变的风险。然而,其转染效率往往比逆转录病毒的转录效率要低得多。

 

CAR-NK细胞有几种类型的慢病毒(LV)正在开发中,近人们对优化vesicular stomatitis virus-G (VSV-G)-pseudo typed LV(VSV-G LVs)的转染很感兴趣。

St. Jude儿童研究医院的研究人员于2021年6月在Cytotherapy杂志发表文章,研究表明,VSV-GLVs转染的NK细胞转染效率低和细胞活力低是由于toll样受体4(TLR4)通路的激活。

 

VSV-G激活TLR4信号通路

免疫系统使用模式识别受体,如toll样受体,来识别细菌和病毒的病原体相关分子模式(PAMPs)。TLR4以其能够识别革兰氏阴性菌外膜上的脂多糖(LPS)而闻名,也能识别病毒。

NK细胞在细胞表面和细胞内均表达TLR4,使得NK细胞对VSV-GLV激活TLR4通路特别敏感。VSV-G激活胞内TLR4信号通路,从而诱导信号级联,终导致I型干扰素的产生。基于以往的研究,我们认为VSV-GLV的转染效率较差,可能是由于TLR4通路的激活所致。因此,Chockley等人研究了使用药物MRT67307抑制TLR4通路的下游信号分子TBK1和IKKε。

 

单细胞功能蛋白质组技术评价基因编辑的NK细胞

研究表明,在转染方案中使用MRT67307,显著提高了NK细胞中HER2-CAR的转染效率,高达18%-53%的细胞表达CAR,平均数为34%。

此外,作者在针对HER2+A549细胞系的4小时细胞毒性实验中评估了CAR的功能,HER2-CAR NK细胞表现出对肿瘤细胞的显著杀伤。在MRT67307的存在下,转染的HER2-CAR-NK细胞的肿瘤杀伤力显著提高。

研究者使用IsoPlexis的单细胞分泌组解决方案评估HER2 CAR-NK细胞的细胞因子分泌谱。与未修饰的NK细胞相比,两种细胞的多功能性(分泌两种及两种以上因子的能力)存在显著差异,主要表现在未经修饰的NK细胞平均分泌2-3个效应分子,其中不到13%的细胞分泌颗粒酶B,少于3.5%的细胞分泌其他细胞因子,多功能细胞占整个细胞的比例小于20%;而HER2 CAR-NK细胞中的部分亚群则能够产生多达10种效应分子,细胞分泌一系列的效应细胞因子,包括:颗粒酶B、穿孔素、TNF-α、MIP1-β、MCP-1、RANTES和IL-8,其多功能细胞占比超过50%

本研究的数据表明,抑制TBK1和IKKε显著改善了NK细胞的转导,并产生了功能完整的细胞产物,与未修饰的NK细胞和没有MRT67307转导的NK细胞相比,CAR-NK细胞表现出更优越的细胞毒性能力。

利用IsoPlexis的单细胞蛋白质组学平台发现的数据,作者能够表征使用VSV-Glv转基因NK细胞的可靠性。该研究的NK细胞转导方法有可能适用于异源基因CAR-NK细胞治疗的临床生产,这在现成的细胞治疗研究领域具有重大的意义。

IsoLight全自动单细胞功能蛋白质组学分析系统

高度集成的系统,包含液体处理器、清洗站、显微镜、细胞培养装置、微阵列扫描仪的高端分析系统,单次24小时内自动化完成8个芯片的检测。

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每张芯片里含有12,000个独立的亚纳升级别的微室,结合微流控技术,可以捕获500-1,500个单细胞。此外,独特的抗体编码技术可实现单细胞水平上多达32种因子的检测。

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