企业案例 | Beacon应用于双特异性抗体细胞株开发

双特异性抗体的细胞株开发

双特异性抗体（简称 “双抗”）是治疗性抗体领域极具创新性的分支，通过基因工程改造，可同时靶向两个不同抗原表位。相较于传统单克隆抗体（简称 “单抗”），双抗能实现天然抗体难以达成的功能，如免疫细胞重定向、双信号通路协同阻断等。凭借更强的靶向性与治疗效能，双抗在肿瘤免疫治疗领域表现突出。目前全球已有多款双抗药物获批用于血液肿瘤及实体瘤治疗，另有超百个候选药物处于临床研究阶段，应用前景广阔。

然而，双抗分子的复杂结构，使其生产用细胞株开发面临显著挑战：

• 分子结构复杂性导致的表达与组装难题；
• 产量与质量的协同调控难度大；
• 细胞株稳定性风险更高。

这就对细胞株筛选的通量和筛选的效率提出了更高的要求：

• 需要筛选更多的mini-pool，才能获得 “高表达+高正确配对率”的候选cell pool用于后续的单克隆筛选；
• 进入单克隆筛选阶段后，尽早地开展“产量+质量”的同步检测，排除“高产量但错配率高” 的细胞克隆进入后续流程，将筛选资源聚焦在更有开发价值的细胞株上。

Beacon®平台结合产量检测（DiGr Assay）、双抗正配率检测（Bispecific Heterodimer Assay）以及聚集体检测（Aggregation Assay），可以在细胞株筛选早期实现细胞株产量与产物质量的多维度评估，将大幅提升细胞株开发的效率和最终产物的品质。最后，Beacon®平台的细胞株稳定性预测功能（Population Dynamics），可以减少RCB建库成本和稳定性试验的工作量，进一步助力双抗细胞株的开发。以下，将展开介绍Beacon®平台的Bispecific Heterodimer Assay的原理和应用案例。

Part.01

Beacon®单细胞光导系统

Bispecific Heterodimer Assay

双抗正确配对比例的检测已成为细胞株开发过程中的关键一环。Beacon®单细胞光导平台，依托纳米流体芯片技术和光电定位技术，可以实现自动化、高通量的细胞株开发流程。除了单细胞分离、单克隆性验证以及高表达细胞株筛选外，Beacon®平台的bispecific heterodimer assay可以在细胞株开发的早期检测非对称双抗的正确配对比例，从而尽早地排除劣质克隆，节省后续验证的资源和人力，提高细胞株开发的效率和项目的成功率。

Beacon®的bispecific assay是在纳升流体芯片上开展的，NanoPen®微型化的体积（1.7nl）使得在细胞株开发早期开展质量检测成为可能。通过两次自定义的定量检测，如分别使用荧光标记的抗原-1和抗原-2开展两次连续检测，分别测得两个抗原的结合信号强度（Calibrated Pen Score），然后根据两个抗原Calibrated Pen Score的比值，比值越接近1:1意味着正确配对的双抗比例就越高，就可以筛选出产物正确配对比例高的优质细胞株。

图1：Bispecific assay的检测原理。

图2：Bispecific assay中Calibrated Pen Score的计算过程。A）Bispecific assay下的NanoPen，其中Channel Signal与Pen Signal的采集区域由蓝框标记。B）通过两点标准曲线计算Calibrated Pen Score，其中第一个点来自参比图像，经过背景扣除和平场校正后，该值坐标为（0,0），第二个点来自检测图像的Channel Signal，同样经过背景扣除和平场校正，其中试剂浓度已事先测定。然后根据Pen Signal（信号来自游离态检测试剂和结合态检测试剂），就可以计算出Pen内积累的产物浓度，即为Calibrated Pen Score。

Part.02

来自Incyte的案例分享

来自美国Incyte公司的专家Wang Shu分享了他们对Beacon®平台bispecific assay的方法学验证工作和细胞株筛选的实例。在建立bispecific assay之前，他们已经利用Beacon®平台开展单细胞克隆和表达量筛选，回收的细胞克隆经扩增后用Octet开展双抗产物正配比例的检测。虽然这个技术路线可以排除掉双抗正配比例低的细胞株，但回收细胞克隆的扩增已经浪费了不少的时间和成本。因此，他们在Beacon®平台上验证和实测了bispecific assay，结果显示bispecific assay能够高效地筛选出优质细胞株，进一步提高了细胞株筛选的效率。

他们选取了一系列已知正确配对比例的细胞克隆、mini pool和bulk pool用于验证。在实验摸索阶段他们发现A594-Ligand B会导致抗体聚集而无法准确检测表达量，因此最终选择了SpotLight Fc和A594-Ligand A开展bispecific assay。测试结果表明，Beacon®的bispecific assay测定的Arm-A:Fc比值与HPLC测定的比值具有非常高的相关性，R2达到0.89（图3）。

图3：Beacon®芯片上开展的bispecific assay检测结果与CEX-HPLC结果具有很好的相关性。

接着他们选取了一个bulk pool作为起始细胞样品，开展了正式的单细胞克隆和bispecific assay检测。如下图中的绿框所示，Arm-A/Fc比值在0.4-0.6，且Calibrated Pen Score数值较大（意味着产物表达量较高）的克隆被认为是“好克隆”。红框圈出的克隆，比值偏离0.5较多，被认为是“差克隆”而被挑取出来。此外，还有一些表达量低的克隆（紫色框）也被挑取出来用于比较和验证。

图4：根据bispecific assay从bulk pool中挑取三组克隆。

初步验证结果表明，按比值0.4-0.6去筛选克隆，可以覆盖绝大部分的真优质克隆。该标准下被筛选出来的21个克隆中，19个克隆具有最高的产物质量（异源二聚体比例>80%）。

图5：根据bispecific assay设定0.4-0.6的筛选范围可以覆盖绝大多数优质克隆。

接着他们选取了42个克隆进入Fed-batch评估，其中7个克隆通过TubeSpin Bioreactor (TPP)评估，其余35个克隆用Ambr15进行评估。然后，研究人员对36个克隆的产物开展了CEX-HPLC分析以测定正配比例，剩余6个克隆因产量不够没有被分析。

用Ambr15开展fed-batch分析的35个克隆中，32个克隆的产量都高于pool的平均产量，最高的克隆产量是pool均值的4倍以上，由此可见Beacon®的产量检测可以有效地筛选出高产细胞株。

图6：Bispecific assay筛选出高产细胞株。

最后研究人员关联分析了36个克隆的CEX数据和Beacon®上测定的比值。结果显示来自Good Ratio组的9个克隆都具有好的正配比例（即True Positive），真阳性率为100%。来自Bad Ratio组的26个克隆，9个具有好的正配比例（即False Negative），17个具有差的正配比例（即True Negative），因此假阳性率为34.6%。为了进一步降低假阳性率，他们重新分析数据，最后确定将bispecific assay的筛选阈值设定为0.3-0.7时，真阳性率维持100%，而假阴性率可以显著降低到15%。因此，适当放宽筛选标准，是一种降低假阴性率的可选策略。实际操作中，可以优先导出比值接近理论值的克隆，然后再适当收集比值在两侧延伸区的克隆，从而既能够保证真阳性率，又能降低假阴性率，保证筛选的效率和克隆的品质。

图7：Bispecific assay实现100%的真阳性率，通过调整筛选阈值可进一步降低假阴性率。（注：图中虚线两侧外的绿色圆点标记的是False Negative，而红色三角形标记的是True Negative）

结 语

Incyte的案例分享，丰富地展示了Beacon®细胞株开发解决方案强大的筛选能力，通过bispecific assay可以帮助研究人员在筛选早期就能够识别出高产且优质的细胞株，从而节省后续验证的成本和时间，并确保了项目交付的成果。