细胞计数仪在单细胞测序中的应用

时间：2025-06-20 来源：上海玮驰仪器有限公司阅读：249

来源：瑞孚迪生命科学

作者：王多鱼

单细胞测序

单细胞测序是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组等遗传信息进行高通量测序分析的一项技术。它能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥重要作用，正成为生命科学研究的焦点。与传统的测序技术相比，单细胞测序不仅测量基因表达水平更加精确，而且还能检测到微量的基因表达子或罕见非编码RNA，其优势是全方位和多层次的。

如何实现单细胞测序
单细胞测序流程包括：单细胞的分离制备、遗传物质的提取扩增以及遗传物质的高通量测序。(图1)

图1.单细胞转录组流程

细胞计数仪在单细胞测序中的应用
在整个流程中高质量的单细胞（核）悬液是实验成功的基础，无论起始样本如何，良好的细胞（核）状态对于有效的细胞捕获和后续进一步研究都至关重要。大多数情况下，研究者会选用新鲜离体的样本制备成单细胞悬液，但是有些样本并不适用，需要进行细胞核抽提制备成细胞核悬液。（例如心脏、肌肉、脂肪等样本由于细胞直径过大，无法被机器捕获。由于有些细胞相对脆弱，单细胞悬液制备过程中会破裂影响实验结果，比如肝脏细胞。神经细胞比较敏感，样本消化过程中会改变某些基因的表达等。）两种方法各有优缺点，根据具体样本和实验选择。

对于得到的单细胞或细胞核样本需要进行质控来确保样本的质量，以10xGenomics单细胞测序平台为例，对于单细胞悬液要求：细胞总量>5x105cells、细胞浓度1x103cells/μl、细胞直径5-30μm、细胞活率>70%、无细胞碎片或其他颗粒物，对于单细胞核悬液要求：细胞活性<5%、尽量无碎片和细胞团、细胞核形态完整。由于单细胞测序样本制备后需要在较短的时间内完成后续遗传物质提取，所以需要进行快速准确的计数。对于这些质控需求我们通过Cellometer系列细胞计数仪即可完成。目前市场上的自动细胞计数仪主要有两种计数方法：基于台盼蓝染色的明场细胞计数和基于AO/PI/DAPI的荧光计数方法，经过大量的实验发现，台盼蓝染色有两个问题。首先，原代细胞样品中含有红细胞、血小板和细胞碎片，在未经纯化的样本中会严重的影响计数结果（图2a），其次，台盼蓝染色会影响不健康的细胞和死亡的细胞，从而低估死亡细胞的数量和活力（图2b）。

图2.使用台盼蓝进行明场细胞计数。（左）样品中有大量非特异性颗粒，难以将PBMC与红细胞和血小板进行区分。（右）台盼蓝影响死细胞的形态，形成深色的扩撒轮廓。

Cellometer系列细胞计数仪不仅支持台盼蓝染色方法，同时支持AO/PI染色方法，采用吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）双荧光混合染料，分别对活细胞和死细胞的细胞核进行染色并自动计数，可以有效避免台盼蓝染色方法中的问题。在单细测序中，大部分都是原代细胞样品或者需要进行细胞核抽提的样本，需要对细胞核进行染色并计数来确定样品制备情况。Cellometer系列细胞计数仪可以通过AO/PI染色对原代或者脆弱的细胞样本（如全血、PBMCs、肝细胞和小鼠脾细胞等）中的有核细胞进行精准的识别计数，其中非有核物体（如红细胞、血小板或碎片等）被排除在外。（图3）

图3. 不同种类细胞计数

细胞的形态多种多样，大小各不相同，因此对细胞计数来说，能够识别和分割不同的细胞类型和形态至关重要。Cellometer软件具有专利性的勾勒细胞轮廓的精确算法，精准识别和计数直径从3-300μm的细胞。对于单细胞测序，为了防止微流控装置堵塞，需要将上机样品制备成单细胞悬液，不能有细胞团块。Cellometer软件可以确定单细胞和细胞团的数量，以确保细胞样品可以进行单细胞测序。（图4）

图4.单细胞和细胞团块计数

Cellometer软件中内置了几百种默认细胞库，满足大部分细胞计数要求，同时对于特定的细胞类型和计数要求，软件中具有多种参数可以定制化调节。在单细胞测序中，单细胞核悬液中的细胞核的数量可以通过PI染色进行定量。（图5）另外Cellometer K2细胞计数仪支持GMP/GLP或21CFR，为实验数据提供安全保证。