从药物初筛到验证：磷酸化蛋白检测的最优技术组合策略

在药物研发与生物标志物分析中，磷酸化蛋白的检测是评估信号通路激活与否的关键环节，目前，常用的检测方法有均相检测技术(HTRF、Lance和AlphaLISA)、流式细胞术（Flow Cytometry）和Western Blot（WB），这三种检测方法各有什么特点？我们如何进行选择呢？各位小伙伴们请往下看！

快速选择指南

高通量筛选？ → 选HTRF和AlphaLISA

需单细胞数据？ → 选流式细胞术

验证未知靶点？ → 选WB

组合策略：WB用于机制探索，流式验证细胞亚群效应，HTRF完成大规模药效评价，可兼顾效率与深度。

均相检测技术（HTRF/LANCE&AlphaLISA）

01

均相检测原理

均相检测技术包括HTRF、Lance和AlphaLISA，以均相的Phospho-STAT3 （Tyr705）检测试剂盒为例，试剂盒中含有一对检测抗体，可分别识别STAT3序列和Tyr705磷酸化位点，且这两个抗体分别携带有供体和受体，当这两种抗体同时与Phospho-STAT3 (Tyr705)结合时，供体与受体在空间上相互靠近，从而产生检测信号，通过酶标仪检测该信号强度，其数值与样品中磷酸化STAT3蛋白的浓度呈正相关。

Principle of HTRF Phospho-STAT3（Tyr705）kit assay.

Principle of AlphaLISA™ SureFire® Ultra™ Phospho-STAT3

02

HTRF/Lance VS AlphaLISA的技术对比

03

均相检测优势

均相检测：无需洗涤步骤，减少操作误差，适合高通量筛选（如384/1536孔板）。

CV值低：数据稳定，整版均一性较好，重复性高。

节省样本：仅需少量细胞裂解液（10–16 μL），适合珍贵样本（如PBMC）。

快速高效：无需包被和洗涤，实验仅需2小时，适合高通量检测。

高灵敏度与特异性：时间分辨荧光技术降低背景干扰，可检测低丰度磷酸化蛋白（如p-STAT3、p-MEK）。

劣势：

如需区分细胞亚群：建议用HTRF/AlphaLISA进行初筛后再结合流式进行细胞亚群的分选。

HTRF Protein detection kit protocol

AlphaLISA Protein detection kit protocol

流式细胞术（Flow Cytometry）

检测原理

固定破膜：甲醛固定细胞，甲醇/去垢剂破膜暴露磷酸化蛋白。

抗体染色：荧光标记抗-p-protein抗体（如p-STAT5-PE）结合靶标。

信号生成：激光激发荧光染料（如PE染料（发射峰578 nm）通过575/26 nm滤片检测），强度反映磷酸化水平。

Principle of Flow Cytometry assay

优势

单细胞分辨率：可分析异质细胞群体中不同亚群的磷酸化状态。

多参数检测：可同时分析表面标志物和胞内磷酸化蛋白（如p-ERK、p-AKT与CD标记共检测）。

动态范围广：适合检测微弱或高度磷酸化的信号，尤其适用于原代细胞或稀有细胞样本。同如上均相检测技术。

劣势：
低通量：胞内染色步骤复杂（固定、破膜易影响表位），实验流程较久，不适合高通量筛选。

设备成本高：流式细胞仪和维护费用较高，数据分析需专业软件。

Flow Cytometry detection protocol

蛋白质免疫印迹（Western Blot）

检测原理

磷酸化依赖的分子量偏移：磷酸化导致ERK构象变化，在SDS-PAGE中p-ERK较ERK迁移慢（表观分子量差异约1-2 kDa）。

抗体识别：一抗特异性识别靶标磷酸化蛋白，二抗偶联HRP或荧光染料，用于信号放大。

Principle of western blot assay

优势

低成本：基础实验室均可开展，适合预算有限的研究。

劣势：

低通量：步骤繁琐（电泳、转膜、封闭、孵育抗体），耗时长达1–2天。

样本需求大：需较多细胞量（通常>10^6细胞/条件），难以分析微量样本。

重复性挑战：转膜效率、抗体批次差异可能影响结果。

Western blot detection protocol

方法对比总结

结语与建议

在抗体药物研发中，磷酸化蛋白检测技术的选择需要综合考量通量、分辨率、成本和样本需求。随着研究精准化需求的提升，多技术联用已成为趋势。

我们推荐：

初筛阶段：HTRF/AlphaLISA高通量筛选

深入分析：流式细胞术单细胞解析

机制验证：Western Blot靶点确认

Revvity提供从靶点发现到临床申报的全周期检测解决方案，如需获取个性化方案或技术咨询，欢迎随时联系我们的专业团队。

Revvity磷酸化试剂盒(部分产品)