双抗活性检测“一步到位”？瑞孚迪均相技术：天然构象、高灵敏度、免洗操作，告别ELISA时代！

BsAb简介

1960年，美国Nisonoff课题组首次提出双特异性抗体（BsAb）的概念。作为一种通过细胞融合、重组DNA或蛋白质工程技术构建的人工抗体，BsAb能同时结合两种不同抗原，展现出比单克隆抗体（mAb）或联合疗法更卓越的治疗潜力。

目前，全球已有22款BsAb药物获批上市，主要集中在肿瘤领域。2024年全球BsAb市场规模约130亿美元，预计到2032年将爆发式增长至2246亿美元。仅2025年上半年，中国BsAb License-out交易总额就高达92.57亿美元，CD3靶向的TCE双抗、PD-1/VEGF双抗等成为热门布局方向。

表1. 中国近年BsAb交易事件（部分）

在结构上，BsAb可分为IgG样和片段型两大类；其作用机制多样，包括细胞桥接、受体桥联、介导复合物形成及“归巢”型，极大拓展了治疗应用的边界。

图1. 双特性抗体结构示例（doi: 10.3390/ijms22105350.）

图2. BsAb作用机制示意图（doi: 10.3390/ijms22105350.）

BsAb结合活性表征方法

双抗结合活性的检测绝非两个单抗检测的简单叠加。它是一个需要精心设计、相互验证的系统工程，旨在确保双抗分子不仅能结合两个靶点，而且是以正确的结构、恰当的比例和期望的方式同时结合，从而驱动其预期的生物学功能。因此，无论是在检测方法的开发、验证还是在整个质控流程中，其复杂性和挑战性都远高于单抗。传统表征方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）和表面等离子共振（SPR），虽技术成熟，但在BsAb的应用中存在明显瓶颈：固相界面效应、难以模拟协同结合、操作繁琐、通量有限。

表2. 双特异性抗体结合活性传统表征方法

瑞孚迪（Revvity）的Alpha与HTRF均相检测技术为BsAb的高通量筛选与质控提供了高效解决方案，凭借其卓越的信噪比、操作简便性、高重复性及更贴近生理状态的溶液相反应环境轻松克服传统方法的局限性，尤其适用于弱亲和力相互作用的检测，显著加速BsAb的开发与稳定性评价进程。

Alpha/HTRF技术原理

Alpha技术是基于供体微珠和受体微珠间的近距离放大的化学发光反应，HTRF技术是基于铕或铽的穴状化合物（供体）与XL665或d2（受体）之间的时间分辨荧光共振能量转移，两者均基于均相检测技术原理，即所有组分在溶液中自由反应并直接读数，无需洗涤步骤。

图3. Alpha/HTRF原理示意图

Alpha/HTRF检测模型

不同结构类型的BsAb都可以使用HTRF/Alpha技术来表征结合活性，以IgG样BsAb为例，其结合活性可通过带有不同标签的抗原（如生物素化抗原与His标签化抗原）及相应标签抗体的toolbox试剂进行评价。

表2. Alpha/HTRF检测模型示意图和实验流程

Alpha/HTRF技术优势

• 高度模拟天然状态：
  均相反应，避免固相化带来的构象改变问题，能更真实地反映结合活性。
• 适用于协同结合检测：
  其信号产生机制要求双抗同时结合两个靶点，可直接、高效地定量评估BsAb的双特异性功能活性，而非简单的单价结合。
• 卓越的弱结合检测能力：
  其均相体系与高信噪比特性，能有效捕捉低亲和力的微弱结合事件，精准解析BsAb与靶点间的弱相互作用（低至pmol-μmol级）。
• 高通量与高效率：
  免洗操作步骤大幅简化流程和减少误差，检测流程约2-3 h，易于实现自动化，适合大规模筛选和常规放行测试。
• 高灵敏度与低样本消耗：
  优异的信噪比，仅使用极少的样本量（约2~5 μl）便可轻松检测BsAb的结合。
• 操作便捷：
  整个操作过程仅需添加试剂、孵育读数即可定量或检测BsAb结合活性。

案例分享

1.使用Alpha/HTRF技术，BsAb结合活性既可通过设置不同的结合实验获得BsAb结合活性的EC50值（三元复合物-夹心法，图4,5），或BsAb筛选的IC50值（竞争法，图6），其灵活的检测模型满足了客户对BsAb结合活性验证的个性化要求。

图4. 抗mTIGIT/mPD-L1和抗mCD200/mCD47 BsAb检测模型

图5. 抗mTIGIT/mPD-L1和抗mCD200/mCD47 BsAb的结合量效

图6. 使用未标记目标蛋白的竞争法结果

2.瑞孚迪基于AlphaPlex™技术，使用不同荧光微球（Eu/Tb），通过捕获不同的发射波长区分Eu/Tb微球信号，可在同一反应中同时检测BsAb与两个不同靶点的结合。AstraZeneca开发的BsAb AlphaPlex方法在50~150%线性范围内表现出99%~107%的准确率，并检测到光应激和热应激条件下>50%的结合降解。此方法适用于BsAb的先导分子筛选、PK/PD分析、临床相容性、商业批次放行和稳定性测试等。

图7. AstraZeneca的BsAb binding检测模型、稳定性研究和方法学验证（doi: 10.1016/j.jim.2021.113099.）

3.瑞孚迪基于AlphaLISA™技术，BsAb在37℃下孵育12天后，检测到BsAb的结合活性受到了影响；基于AlphaPlex™技术，进一步揭示了BsAb在37℃下，BsAb与PD-L1的结合是稳定的，但与TIGIT的结合能力则受到了影响。AlphaPlex™特别适用于分析某个靶点的结合能力是否受损。

图8. BsAb强制降解研究

4.在某些双特异性抗体中，可能存在与抗原结合亲和力较低的情况。例如，为降低毒性效应，部分T细胞衔接器（TCE）类药物会通过工程化改造降低其与CD3的结合强度。若采用酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测，洗涤步骤易导致此类低亲和力结合复合物的解离，从而无法有效捕获信号或CV值较大。而瑞孚迪的Alpha/HTRF平台作为一种均相检测技术，无需洗涤步骤，可在溶液相中直接检测低至微摩尔（μM）级别的弱分子互作，显著提高对低亲和力结合事件的检测灵敏度。

图9. 低亲和力分子互作案例（doi: 10.1021/acschembio.6b00286.）