CRISPR基因编辑的干细胞单克隆分选神器—Cytena单细胞打印技术剖析

来源：医麦客

作者：细胞市场部

CRISPR/Cas9基因编辑技术一经诞生就被视为21世纪最为重要的生物发现之一。由于其稳定高效，CRISPR/Cas9技术已经成为科研界和工业界实现基因组编辑的强大工具，而基因修饰细胞的同质性是细胞系开发、基因治疗和组织工程，尤其是再生医学等许多应用的必要条件。细胞筛选和验证过程仍是当今克隆工作流程中不可或缺的一部分，但其缺乏有效分离和表征工程改造细胞的工具被认为是这些应用中的一个重要瓶颈。

大多数基因工程方法，以CRISPR/Cas9为例，细胞通过非同源末端连接进行修复，这个容易出错的过程，通常会导致脱靶、单等位基因修饰和未编辑等非同质细胞产生。因此，在使用前，必须对细胞进行分离并克隆鉴定，确保其克隆性和谱系可追溯性，这不仅对制药、细胞治疗等非常重要，也是EMA和FDA监管要求所强制执行的。另外，基因组上正确的修饰不能确保预期的基因表达变化，因此需求验证必须要对基因组、mRNA表达和蛋白质水平上进行高内涵表征。

最近，Tobias Gross等人提出了一个改进且更并行的工作流程，解决了传统细胞扩增昂贵、易失败且耗时等问题，还提供了低细胞分析。无需过多的克隆扩增，即可收获满足质量要求的具有深度表征的单细胞克隆。

以最小克隆扩增建立和表征CRISPR/Cas9编辑细胞的改进工作流程，通过SCP检测GFP信号，分离并分选转染gRNAs的细胞。

用pmaxGFP质粒和含有针对TNFSF11不同gRNAs的GFP标记基因的pNV RANKL/KO质粒CRISPR/Cas9敲除载体分别电转染hTERT MSC。RANKL通过OPG/RANKL/RANK通路协调骨生成成骨细胞和骨降解破骨细胞之间的平衡，通过敲除TNFSF11基因，转基因骨髓间充质干细胞及其祖细胞不能再募集破骨细胞，以提高hTERT MSC骨形成能力。pmaxGFP转染的hTERT-MSCs作为对照来评估打印、分选和克隆效率，并优化该过程。

电转染细胞在37℃/5% CO2下培养24小时后，使用荧光分选的单细胞打印SCP技术（Cytena，f.sightTM）选择并打印GFP表达的细胞，并根据大小（15-30μm）和圆度（0.6-1）的形态学标准对其进行分选。f.sightTM将细胞打印到96孔板（每孔200μl培养基），并在打印过程中对打印细胞进行连续拍摄记录，证实克隆来自于单个细胞。（如下图显示）

只有符合要求的且含单个细胞的液滴被打印到孔板中

SCP记录的五张图像，转染并表达GFP的hTERT-MSC的分离过程，喷射前01-03喷射时04和喷射后05

红色标记的点表示被分选事件，表明GFP表达的MSC具有潜在RANKL敲除

pmaxGFP转染hTERT-MSCs单细胞打印参数：激光强度20-40%，曝光时间15-30ms，荧光阈值30-250RFU，pNV RANKL/KO转染hTERT-MSCs的激光强度90-95%，曝光时间80-120ms，荧光阈值50-250RFU。

作者同时对打印细胞底板成像进行手动评估，即荧光单细胞是否被成功分选并打印，或者是否将含多个、数量不确定、无细胞或非荧光细胞被送入孔中。共451个转染的打印细胞，荧光单细胞打印效率为93.9±2.7%，只有6%的孔为无效打印，与f.sightTM所获结果一致，提供>99.99%的保证。（如图F显示）

作者还注意到96孔板培养的已分选单细胞，转染hTERT-MSCs（31.3±8.0%）和未转染hTERT-MSCs（39.6±15.6%）的克隆效率差异很小，表明分选/打印过程是温和的（对细胞剪切力可与手动移液相媲美），可以最小程度引入系统偏差。2周后对单个细胞获得的克隆进行计数，确定克隆效率（n=227个转染的打印细胞，n=650个未转染打印细胞）。（如图G显示）

这些结果证实，f.sightTM可以从形态学上区分细胞，并可对不同荧光强度的细胞进行分选，GFP信号强的pmaxGFP转染hTERT MSC和GFP信号弱的pNV RANKL/KO转染hTERT MSC均成功分类。

在进行转染后，必须分离单个细胞，以产生可验证为有效敲除的克隆。有限稀释法和荧光激活细胞分选（FACS）很常见，但在效率、选择控制和细胞活力等方面都不理想。有限稀释法虽然经济，可能比FACS分选对细胞造成损伤小，但不能验证其是由单个细胞长成的克隆，而且耗时耗资源，可能还会有些人为因素的影响；FACS虽然对单细胞有良好控制且通量高，但分选时产生的高剪切力和持续静电，会对敏感或部分受损细胞（如电转）的存活率/克隆效率有很大不良影响。

而正在兴起的单细胞打印技术脱颖而出，它以一种非常温和、低成本和高度可控技术，适合从0~40μm的各种特异性细胞克隆应用。通过专利的喷墨式打印技术将单个细胞非接触式的分离到标准的96/384/1536孔板中，实现高通量工作流程。特别适用于工程细胞的克隆，在维持细胞原有生命活力的同时，还为单细胞克隆性提供了直接的证据（提供每个打印细胞的可靠记录），可根据细胞直径、圆度和荧光强度进行分选，并且可以整合到其它单细胞分析管路上，与各种下游流程的兼容性。不需要大规模克隆扩增细胞，即可在细胞发育早期、高度并行阶段得到包括DNA、RNA和蛋白质水平等全面表征，降低了发育过程中后期失败的机会。

通过自动化方式替代劳动密集和耗时的步骤来简化细胞系开发等工作流程

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