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转载|Nucleofector高级电转技术应用:基因组编辑

时间:2021-05-07 来源:上海玮驰仪器有限公司 阅读:918

基因组编辑

基因表达调控的方式有很多种,但不外乎在DNA水平、RNA或蛋白质水平进行调控。多数的方式仅能对基因进行高效的、瞬时的调控,这在某些应用场景下非常有优势。也可以通过质粒、转座子、病毒的随机整合或同源重组完成稳定的和可遗传的DNA修饰。但是,要实现位点特异性的整合是非常耗时且困难的。随着先进的基因组编辑工具不断被发现,位点特异性稳定修饰变得更容易实现。

 

在过去的十年中,锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)技术被确立为位点特异性基因组修饰的有用工具,但随着近规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)技术的出现,它成为了另一种有效的替代方案。

 

通过基因组编辑靶向修饰细胞DNA为基础生物学研究、早期药物发现和新型细胞疗法(例如免疫疗法)的开发提供了强有力的工具。

 

CRISPR技术利用工程化核酸酶在靶基因组位置删除、插入或替换基因(Gaj et al., 2013)。Cas9核酸酶在基因组DNA中产生双链断裂,从而诱导两种可能的细胞修复过程:1.非同源末端连接(NHEJ)可导致功能基因的缺失,因为它在关闭断裂时通常伴随突变。2.如果可获得部分同源供体序列,则可通过同源依赖性修复(HDR)进行基因的插入或替换。为了在特定靶序列上进行这种修饰,核酸酶与序列特异性DNA结合,将核酸酶导向靶序列。

 

基因组编辑工具

如上所述,对于基因组编辑,工程化核酸酶用于在靶基因组特定位置删除,插入或替换基因。这种工程化核酸酶通常由两个元件组成:内切核酸酶DNA切割模块和序列特异性DNA结合结构域。核酸酶切割双链DNA,产生双链断裂(DSB)。DSB诱导细胞DNA修复过程。这可能会发生两种类型的修复过程,1.如果没有可用的同源供体片段-无论是相应的等位基因还是外部供体DNA-断裂的末端将被重新连接。该过程称为非同源末端连接(NHEJ),并且通常可能导致基因功能元件缺失的突变。

 

如果存在同源的序列,例如基因组等位基因或外源供体DNA,则可以通过同源重组修复(HDR)进行基因的插入或替换。NHEJ与HDR的频率取决于实验设置,例如细胞类型和供体量。

这些核酸酶与序列特异性DNA结合结构域的组合可以定制以识别几乎任何序列,以位点特异性的方式进行基因组编辑。

 

常用的位点特异性的基因组编辑工具有以下三种:

·   ZFN

·   TALEN

·   CRISPR/Cas9

 

CRISPR/Cas9

CRISPR技术来源于细菌防御病毒入侵的途径,目前已经广泛地应用于真核生物的基因组编辑。相较于ZFN和TALEN,它更具有灵活性。

 

与ZFN和TALEN相比(详见下文),基于CRISPR的基因组编辑依赖于两个独立的组件一起工作:

 

CRISPR-Cas9
 

DNA靶向部分: 所谓的靶向RNA(gRNA),通常与18-21bp的基因组DNA片段互补。

Cas9核酸酶:一旦gRNA与基因组DNA链配对,Cas9核酸酶就会切割基因组DNA,引起双链断裂。

 

由于DNA特异性部分是RNA分子,因此比ZF-或TALE-核酸酶融合蛋白更容易设计和生产。此外,通过将Cas9核酸酶与靶向不同位点的几种gRNA一起转移,可以进行多基因组编辑。

 

基于CRISPR-Cas9的细胞共转染方案
 

· 转入一个同时包含gRNA和Cas9核酸酶的质粒

· 共转入两个单独的质粒(一个含有gRNA,另一个包含Cas9)

· 共转一个包含Cas9的质粒和一个可以表达gRNA的PCR序列

· 体外组合的Cas9-gRNA的RNP复合物

· 如果是为了插入或替换,还需要再共转一个供体DNA质粒或一个单链核苷酸(ssODN)

Lonza独有的NucleofectorTM高级电转技术已被证明可作为基于CRISPR的基因组编辑工具的可靠转染方法

 

NucleofectorTM高级电转技术特点
 

1.广泛的细胞类型(包括iPSC)具有高转染效率

2.有效地共转染各种底物

3.使用简单,转染质粒、DNA、mRNA、PCR序列或ssODN时可采用相同的实验条件

(Ran et al., 2013) Nature Protocols出版物提供了关于使用4D NucleofectorTM系统进行CRISPR转染的非常全面的指南。

 

ZFN

锌指(ZF)蛋白是自然界中丰富和通用的DNA结合结构域(Tupler R et al., 2001)。单个锌指结构域结合3个DNA碱基对。由于它们的模块化结构,它们为设计人工序列特异性结合分子提供了理想的框架。ZF与内切核酸酶(主要是Fok1)的融合构建了锌指核酸酶(ZFN)。两种这样的ZFN组合起作用以结合靶DNA序列的有义和反义链。结合后,Fok1核酸酶形成活性二聚体并诱导双链断裂,引起随后的细胞修复过程。

 

 

 

TALEN

2009年,科学家们发现转录激活因子样效应子(TALEs)可作为更简单的模块化DNA识别蛋白(Boch et al., 2009; Moscou et al., 2009)。TALE是来自植物病原菌属Xanthomonas天然存在的蛋白质,并且含有DNA结合重复序列,每个重复序列识别单个碱基对。与锌指的基于三联体的DNA结合相比,TALE-DNA结合重复的这种单碱基识别模式使得设计具有更大的灵活性,但也存在一些克隆挑战。同样,工程化的TALE通常与Fok1核酸酶融合以构建TALE核酸酶融合物(TALEN)。与ZFN一样,必须为每个靶标产生一对TALEN,每个单体结合(Jinek et al., 2013) 靶DNA的有义或反义链。

 

 

引用文献

1.Gaj T et al. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology 31(7):397-405 (review) 

2.Petit CS et al. (2013) J Cell Biol 202:1107-1122 (cells: HeLa) 

3.Ran FA et al. (2013) Cell 154:1380–1389 (cells: various cell lines, e.g. HEK293FT) 

4.Ran FA et al. (2013) Nat Prot 8(11):2281–2308 (cells: HEK293 and HUES62)

5.Seki and Rutz. (2018) J Exp Med 215(3):985-997 

6.Tupler R et al. (2001) Nature 409: 832-833 
7.Boch J et al. (2009) Science 326 (5959): 1509–12 
8.Jinek M et al. (2013) eLife 2: e00471 
9.Moscou MJ et al. (2009) Science 326 (5959): 1501 

 

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