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快速、高效AAV衣壳蛋白分析助力基因治疗药物研究

时间:2024-01-05 来源:上海玮驰仪器有限公司 阅读:228

 

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病,以达到治疗目的。基因治疗的载体在基因治疗过程中起着至关重要的作用,一些病毒制剂和人工递送技术已经被用来尝试安全地将蛋白受体或核酸载体递送到宿主细胞中进行复制,起到治疗效果。然而,一些病毒载体的不良特性,包括它们的免疫原性,或它们引起的强烈副作用,已经导致了严重的临床不良事件,并限制了它们目前在临床中的某些应用。

腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)因具有低致病性、对宿主免疫原性弱、长期稳定表达、广泛的细胞和组织亲嗜性等优点而被广泛用于研发和临床应用领域,是目前研究最活跃的基因治疗载体之一,已经有超过200个AAV药物进入临床试验和3个药物已上市。AAV由一个蛋白质衣壳组成,该衣壳包裹着一个大小约为4.7kb的小基因组,并依赖于与辅助病毒的共感染来进行复制。AAV衣壳由三种病毒蛋白(VP1、VP2和VP3)组成,其比例、鉴别、纯度影响药物效能和效价强度,需要被鉴定并监控以确保药物质量。AAV衣壳是病毒基因组的保护结构,也是病毒复制的起源和包装信号,是影响病毒感染活性和基因转导的关键因素。不同血清型之间的衣壳蛋白质具有较高一致性,因此在基因治疗方法的开发和商业化过程中需要使用高效、可靠的载体鉴定方法。

 

为使VP1、VP2和VP3可视化,我们利用SDS-PAGE银染法来产生定性数据,此过程耗时费力且重现性差。LabChip®GXII Touch™蛋白分析系统提高了AAV纯度分析的速度、通量和数据质量。利用SDS存在下的微流控毛细管电泳技术分离AAV衣壳蛋白,并测定每种病毒衣壳蛋白的大小和浓度。

 

LabChip®GXII Touch™系统的ProteinEXact™试剂采用系统校准步骤,可实现高精度重现性,并具有更高的灵敏度和较宽的分析范围。65秒内即可完成样品分析。这种高通量的分析方法可以同时测定96份AAV样品,并提供传统毛细管电泳无法比拟的可比结果。

 

  • 利用ProteinEXact™试剂,LabChip®GXII Touch™蛋白分析系统可以提供:
  • 定量和数字化的结果
  • 标准化分析流程
  • 多个用户、多台仪器上结果的可重复性
  • 分析速度快
  • 高通量

 

图1:(A) LabChip® GXII Touch™仪器(B)芯片,可测试多达400个样品(C)显示蛋白质如何在微流控通道中得以分离和脱色

 

Protein EXact™ Assay检测AAV衣壳蛋白

 

AAV的热稳定性因血清型不同而有所变化,衣壳蛋白组成的比例类似,即VP1:VP2:VP3=1:1:10²。LabChip®GXII Touch™蛋白鉴定系统采用PerkinElmer的ProteinEXact™分析技术,利用IntelliChip™分析优化技术,使样品的蛋白浓度分析具有高分辨率和可重复性,从而使重组病毒生产的AAV鉴定具有最高的准确性。

 

图2:AAV8完全变性后衣壳蛋白Labchip电泳图谱,样品重现性好

 

几种血清型(AAV2、AAV8和AAV9)的空衣壳颗粒被用于这些实验。为了分离衣壳颗粒,AAV样品在洗涤剂的存在下反复加热。由于不同的AAVs具有不同的稳定性,因此对每个血清型分别选择了不同的温度。如图2所示,完全变性的AAV8颗粒在SDS存在的情况下,在80℃加热后,只有三个峰的分子量分别为80、90和115kDa左右。

 

AAV动力学观察实验(稳定性)

 

为了研究AAV变性的时间条件,对每个重组构建体进行了动力学实验。LabChip™GXII Touch™蛋白鉴定系统能够在30-50秒内收集多达300个实验点,这可能为衣壳蛋白提供额外的信息。

 

图3A和3B:动力学实验中部分变性的AAV8(图3B—只显示二聚体)

 

部分变性衣壳可由不同蛋白质分子量(单体、二聚体、三聚体等)的混合物组成,如图3所示。在实验期间。在1% SDS和TE缓冲液中加入AAV样品的96孔板被加热到特定的温度进行变性,随后进行检测。

 

AAV糖基化检测实验

 

一些研究者在LabChip®GXII Touch™蛋白表征系统的实验中,观察到VP3的主要峰上有明显的“小峰”。最近,Sara Murrey等人报道了AAV2衣壳蛋白的糖基化,并从理论上估算了衣壳蛋白表面糖基化的四个可能位置。为了研究衣壳糖基化的假设,我们使用我们研发实验室之前开发的酶处理(PNGase F消化)对AAV2、AAV8和AAV9颗粒进行去糖基化;图4中的数据显示了处理前(a)和处理后(b)的AAV8。在图4b中,观察到VP3峰的分子量变化为79 kDa,而图4a中未处理的VP3的分子量变化为81kDa。对于VP2 (92kDa vs. 94kDa)和VP1 (113kDa vs.115 kDa),可以观察到大约2kDa的相同变化。观察结果与衣壳蛋白上糖基化的平均分子量一致。

 

图4A和4B:变性AAV8去糖基化结果

 

为了证明去糖基化的再现性,我们对变性的AAV颗粒进行了额外的实验。图5显示了与图4相同的三种衣壳蛋白分子量变化的重叠电泳图。此外,在LabChip®GXII Touch™蛋白分析系统中也可以显示虚拟胶图结果,其前后的分子量变化非常明显。

 

图5:去糖基化前后AAV8检测结果

 

我们展示了LabChip®GXII Touch™蛋白分析系统上利用ProteinEXact™对AAV样品进行多项检测的结果,证明该平台提供AAV衣壳蛋白的全面分析的能力。该方法为AAV衣壳蛋白鉴定提供了一种快速、高通量、稳定可靠的方法。高重现性和准确的衣壳成分检测可以作为重组AAV病毒颗粒表征的新方法,是基因治疗应用的关键一步。另外,衣壳蛋白糖基化的高分辨率验证进一步有利于重要治疗成分的生产。