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EnVision在高通量SNPs分型检测中的应用

时间:2023-11-29 来源:上海玮驰仪器有限公司 阅读:89

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是DNA序列中单个核苷酸替换导致的,通常SNP位点构成两个等位基因。在人类基因组中,具有丰富的SNPs,据预测每1000个碱基就会有1个SNP发生。SNPs位点与许多人类疾病相关,包括癌症、代谢疾病、自身免疫疾病、神经性疾病、传染病等。另外,研究SNPs对畜牧养殖、农作物育种也有非常重要的意义。对于SNPs分型分析除了传统的DNA测序、毛细管电泳、质谱、色谱法,我们还可以通过EnVision多功能酶标仪的多种检测模式进行高通量SNPs分型分析。

方案一

经典的FP-TDI单核苷酸多态性检测

FP-TDI(template-directed dye-terminator incorporation assay with FP detection)是经典的SNPs分型检测方法,如下图,定序引物是一种未经修饰的引物,其3’端靠近多态或突变位点的上游。当加入不同荧光团标记的ddNTP、DNA聚合酶和靶标DNA孵育时,等位基因特异性标记ddNTP与TDI引物结合。激发反应中的荧光染料来检测FP信号的变化,可以简单快速地确定靶标DNA分子的基因型。应用EnVision FP检测模式,不论是单链合成DNA寡聚核苷酸还是PCR扩增产物双链DNA片段,都可以作为FP-TDI检测模板,检测方法的高灵敏、高特异性得到验证。

 

方案二

AlphaScreen均相SNPs分型检测技术

AlphaScreen技术可用于开发高通量核酸检测,如下图,通过通用寡核苷酸将探针分别桥联在供体和受体微珠上,通过探针结合靶基因序列达到检测目的 。这种方法可以检测到浓度低至10amole的单链DNA。AlphaScreen与等位基因特异性扩增(ASA)和等位基因特异性杂交(ASH)的结合,可开发两种均相单核苷酸多态性(SNP)基因分型平台。这两种类型的检测都非常灵活、稳定、准确,每个基因型的基因组DNA样本含量仅需2ng。使用ASA分析对12个SNPs和使用ASH分析的7个SNPs进行了AlphaScreen验证研究。580多个样本进行了基因分型,准确率>99%。这两种检测方法非常简单,不需要PCR后操作。在96孔和384孔板中成功地进行了基因分型,体积低至2μL,大大减少了基因分型所需的试剂和基因组DNA的数量。

方案三

基于化学发光双报告基因检测的SNPs功能分析

SNPs调控的蛋白表达,在畜牧养殖、育种有着非常重要的意义。β-乳球蛋白是牛奶中主要的乳清蛋白,约占牛奶总蛋白的10%,但有可能导致食用后过敏。一项关于杂合子奶牛乳汁中BLG B亚型浓度的全基因组关联研究(GWAS)检测到BLG基因内或附近存在一组高度显著的单核苷酸多态性(SNP)。其中BLG基因第1外显子+78 bp处存在同义G/a突变(chr11:103256256G>a)。在转染的CHO-K1和MCF-7细胞中的荧光素酶报告分析中评估了该SNP的A等位基因(称其为B’)对BLG表达的影响,通过EnVision化学发光双报告基因检测发现,B’纯合子大大降低BLG蛋白表达量。另外发现,携带B’ BLG等位基因奶牛产奶所含的酪蛋白含量非常高,有助于提供乳酪产量。因此,通过高通量SNPs筛选,可以获得优良的品种。