EnVision在高通量SNPs分型检测中的应用

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是DNA序列中单个核苷酸替换导致的，通常SNP位点构成两个等位基因。在人类基因组中，具有丰富的SNPs，据预测每1000个碱基就会有1个SNP发生。SNPs位点与许多人类疾病相关，包括癌症、代谢疾病、自身免疫疾病、神经性疾病、传染病等。另外，研究SNPs对畜牧养殖、农作物育种也有非常重要的意义。对于SNPs分型分析除了传统的DNA测序、毛细管电泳、质谱、色谱法，我们还可以通过EnVision多功能酶标仪的多种检测模式进行高通量SNPs分型分析。

方案一

经典的FP-TDI单核苷酸多态性检测

FP-TDI(template-directed dye-terminator incorporation assay with FP detection)是经典的SNPs分型检测方法，如下图，定序引物是一种未经修饰的引物，其3’端靠近多态或突变位点的上游。当加入不同荧光团标记的ddNTP、DNA聚合酶和靶标DNA孵育时，等位基因特异性标记ddNTP与TDI引物结合。激发反应中的荧光染料来检测FP信号的变化，可以简单快速地确定靶标DNA分子的基因型。应用EnVision FP检测模式，不论是单链合成DNA寡聚核苷酸还是PCR扩增产物双链DNA片段，都可以作为FP-TDI检测模板，检测方法的高灵敏、高特异性得到验证。

方案二

AlphaScreen均相SNPs分型检测技术

AlphaScreen技术可用于开发高通量核酸检测，如下图，通过通用寡核苷酸将探针分别桥联在供体和受体微珠上，通过探针结合靶基因序列达到检测目的 。这种方法可以检测到浓度低至10amole的单链DNA。AlphaScreen与等位基因特异性扩增（ASA）和等位基因特异性杂交（ASH）的结合，可开发两种均相单核苷酸多态性（SNP）基因分型平台。这两种类型的检测都非常灵活、稳定、准确，每个基因型的基因组DNA样本含量仅需2ng。使用ASA分析对12个SNPs和使用ASH分析的7个SNPs进行了AlphaScreen验证研究。580多个样本进行了基因分型，准确率>99%。这两种检测方法非常简单，不需要PCR后操作。在96孔和384孔板中成功地进行了基因分型，体积低至2μL，大大减少了基因分型所需的试剂和基因组DNA的数量。

方案三

基于化学发光双报告基因检测的SNPs功能分析

SNPs调控的蛋白表达，在畜牧养殖、育种有着非常重要的意义。β-乳球蛋白是牛奶中主要的乳清蛋白，约占牛奶总蛋白的10%，但有可能导致食用后过敏。一项关于杂合子奶牛乳汁中BLG B亚型浓度的全基因组关联研究（GWAS）检测到BLG基因内或附近存在一组高度显著的单核苷酸多态性（SNP）。其中BLG基因第1外显子+78 bp处存在同义G/a突变（chr11:103256256G>a）。在转染的CHO-K1和MCF-7细胞中的荧光素酶报告分析中评估了该SNP的A等位基因（称其为B’）对BLG表达的影响，通过EnVision化学发光双报告基因检测发现，B’纯合子大大降低BLG蛋白表达量。另外发现，携带B’ BLG等位基因奶牛产奶所含的酪蛋白含量非常高，有助于提供乳酪产量。因此，通过高通量SNPs筛选，可以获得优良的品种。