细胞培养在科研和生物制药中被广泛应用,支原体污染问题频繁出现,污染会影响细胞的生长、形态、生化特点和遗传特征。因此,为了提高生物制品的有效性和安全性,各国监管机构和法规都建议使用适当的检测方法对细胞进行检测,以确保使用的细胞无支原体污染。
迄今为止,已经有多种支原体检测方法,包括培养法、指示细胞法、基于核酸扩增(NAT)的方法和基于酶促反应的方法(生化法),每种方法都有各自的特点和应用范围。培养法作为经典方法,通过有无支原体生长进行判断,直接,但是检测时间是一个大的挑战;指示细胞法检测时间稍微有所缩短,但是灵敏度是一个问题。NAT方法检测时间短,是直接对支原体的核酸进行扩增,但是覆盖率和准确度以及对死活支原体的区分有一定的挑战;基于酶促反应的生化法检测的时间短,对活的支原体进行检测,灵敏度适中。
生化法是基于支原体的生化活性的检测方法,相关试剂盒可检测支原体酶,如乙酸激酶和氨基甲酸酯激酶。这些酶能够在磷酸乙酰基和磷酸氨基甲酰基底物存在下催化ADP转化为ATP,进而在荧光素酶作用下使得荧光素底物反应释放化学发光信号。灵敏度较高、准确、特异和快速(20mins)是生化法检测的主要优点。推荐用于细胞、培养基、血清等样品的快速污染检测和筛查。
生化法检测原理:
题为“Sensitivityof biochemical test in comparison with other methods for thedetection of mycoplasma contamination in human and animal cell linesstored in the National Cell Bank of Iran”论文采用培养法、生化法(LonzaMycoAlert®试剂盒)和PCR法对细胞库大量的细胞进行污染检测,并对这些方法的敏感性、特异性、准确性和便捷性(速度)进行了比较,认为MycoAlert生化法由于其灵敏度、特异性和检测速度的多方面优势,可被视为传统微生物培养和DNA染色荧光染料方法的替代方法。这与美国药典(USP)的描述内容一致,“Avalidated nucleic acid amplification technique(NAT) or an enzymaticactivity based method may be used to detect Mycoplasma”。
该研究中,研究人员随机选取了40种不同的人和动物细胞系,分别以Vero和NSO细胞系为阳性和阴性对照,使用培养法、生化法和PCR方法进行支原体检测。结果汇总如下:
检测结果进行SPSS统计学分析并以培养法为参照,计算阳性和阴性结果的敏感性、特异性、准确性和预测值,统计结果见图1。
由此结果可以看出:生化法具有出色的灵敏度、准确度、特异性,而且检测时间短(<20mins),可以成为培养法和染色法的较好替代。该方法只能检测活的支原体,因此可以跟PCR法形成较好的检测互补。
研究中所使用的生化法试剂盒MycoAlert来自于Lonza,作为业内经典的生化法支原体检测试剂盒,其检测灵敏度为<50cfu/mL,对A.laidlawii、M.hyorhinis和M.orale的灵敏度为10~20cfu/mL。
目前Lonza已经推出了升级版本的支原体试剂盒MycoAlert®Plus,除了可以在Lonza Lucetta™ 2检测设备之外,由于其更佳的检测灵敏度,还可以使用各种酶标仪进行高通量支原体检测。
产品特点:
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