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快速、高效、灵敏、多维度,PerkinElmer LabChip AAV衣壳蛋白分析助力基因治疗药物研究

时间:2022-06-02 来源:上海玮驰仪器有限公司 阅读:307

重组腺相关病毒有组织特异性高、安全性好、免疫原性低等等优点,目前被作为基因治疗中常用的病毒载体。行业内常采用三质粒或二质粒系统进行细胞转染,进而获得不同血清型的重组AAV载体。其中Cap基因编码VP1、VP2和VP3三种衣壳蛋白和组装激活蛋白。VP1与病毒从体内逃逸有关,对感染性至关重要;VP2对于组装或者感染必不可少;VP3核心保守序列β-桶结构决定了不同血清型AAV与宿主细胞作用受体的差异,三者组装成直径约25nm的二十面体病毒颗粒,形成病毒衣壳,充当病毒基因传递载体。

图1:AAV病毒及组成示意图

AAV衣壳属性是影响病毒感染活性和基因转导的关键因素,其比例、鉴别、纯度、空壳率影响药物效能和效价强度。因此在基因治疗产品的整个开发过程中,需要对AAV衣壳的结构、性质及其蛋白质组成进行充分表征和监测,为确保药物的安全性和有效性。ELISA、免疫印迹法常用于确定功能和组成信息,但是无法做到AAV衣壳蛋白的表征。SDS-PAGE和银染常用于衣壳蛋白研究,但是检测时间较长,且常常发生凝胶过热、过载、染色/脱色标准化不足等问题,导致实验结果的误差,检测通量不大。此外,分析型超速离心方法(AUC)方法和质谱方法也被用于VP蛋白分析,但分析通量有限。因此,行业内亟需寻找一种高通量、准确、灵敏的方法,用于衣壳蛋白组成、纯度、比例及糖基化等表征。

 

PerkinElmer LabChip GXII Touch微流控毛细管蛋白分析系统配套ProteinEXact芯片和试剂盒被广泛用于AAV衣壳蛋白分析。65秒内运行150 nl样品即可完成样品分析。灵敏度比银染灵敏度高一个数量级,可低至0.2ng/uL。作为一种全自动和高通量的检测方法,为AAV颗粒质量研究带来了一种定量和可重复的方法。其检测原理是:带电荷样品在电场中迁移,结合的荧光基团会被LIF检测器检测。一张芯片整合了SDS-PAGE的所有流程:上样,分离、染色、脱色和检测,直接从96 孔板或384孔板采样,通过软件即可快速实现蛋白或核酸分析,使用方便且可无人值守,化繁为简,同时保证检测通量和数据质量,具有准确定量研究AAV蛋白的潜力。是一种快速、定量且可重复的AAV分析替代方案,目前已用于蛋白分子量、纯度、比例和稳定性分析、糖基化以及AAV血清型分析等等。

图2:LabChip GXII Touch仪器及工作原理。A.仪器外观图;B.芯片及进样针;C.荧光图像显示蛋白质如何在微流体通道中分离和脱色;D. ProteinEXact试剂盒

 

衣壳蛋白纯度、比例研究

实验人员使用PerkinElmer LabChip GXII Touch系统对AAV8衣壳蛋白进行了定量分析,并对VP1、VP2、VP3和杂蛋白大小、分布、浓度和含量百分比进行了计算。该结果可以与文献报道的纯化样品SDS-PAGE银染结果进行了直观比较。

图3:完全变性的AAV8微流控毛细管电泳结果与精纯方法SDS-PAGE银染对比结果

那么,该系统检测重复性如何呢?在对同一样品进行12次重复实验后发现,该系统对VP1、VP2、VP3检测具有良好重复性。取12次实验的VP1、VP2和VP3浓度的平均值,比值为1:1.7:11.3,与预期比例1:1:10接近。

图4:变性AAV8的12次重复实验数据汇总

 

AAV血清型分析

通过对VP1、VP2和VP3峰的分析,还可以用于AAV血清型确认。实验中前处理必须确保衣壳蛋白完全解离,以便于血清型分析。基于各种血清型AAV的VP分子量大小和组成差别,可以通过LabChip GXII系统,对AAV2、AAV5、AAV8血清型进行了良好的区分。

图5.不同的AAV血清型(AAV2、AAV5、AAV8)衣壳蛋白微流控毛细管电泳峰图

 

稳定性及聚体动态研究

AAV衣壳蛋白解离温度不同,因此AAV的稳定性也不相同。在对AAV2、AAV8和AAV9的空壳研究实验中,样品加入SDS80℃反复加热充分破坏衣壳,使用LabChip GXII毛细管电泳系统分析发现完全解离的AAV8颗粒有三个峰,部分破碎的衣壳可以形成不同蛋白质分子量聚集体:单体,二聚体,三聚体等混合物以及完整颗粒。该系统的检测时效性和通量可以为衣壳解离或组装动态研究提供了极大的便利和数据支撑。

图6.AAV8热稳定动力学数据(a-二聚体和三聚体同时存在;b-只有二聚体存在)

 

AAV糖基化分析

衣壳蛋白的翻译后修饰对病毒感染嗜性和免疫原性有较大的影响。在以上峰图中也可以清楚看到了VP3的“肩峰”,这个跟文献报道一致,Sara等也发现了AAV2衣壳蛋白的糖基化,并推测了衣壳蛋白表面的四个糖基化位点。为了证实该推测,研究人员对AAV2,AAV8和AAV9衣壳蛋白进行了PNGaseF酶切去糖基化。结果显示去糖基化前后的确有分子量变化,处理前分子量VP1、VP2、VP3分别为115kDa、94kDa、81kDa,处理后为113kDa、92kDa、79kDa,大约减小2kDa,与附着在衣壳蛋白上的聚糖的平均分子量一致。凝胶图上酶切前后分子条带也显示了位移[9]。Aloor等的报道在AAV8中发现了多个N-糖基化位点,质谱分析鉴定到了N499位点N-糖基化。Mary等对AAV中多种PTM修饰及糖基化位点进行了汇总。

图7.AAV8衣壳蛋白去糖基化及分析

以上,我们介绍了使用PerkinElmer LabChip GXII Touch 微流控蛋白分析系统搭配ProteinEXact芯片和试剂盒进行AAV样品的分析检测,证明了该平台提供病毒蛋白全面分析的能力,可以为重组病毒颗粒衣壳蛋白组成、比例、纯度、糖基化分析提供了一套重复性高和精确度好的表征新方法,还为AAV血清型鉴定提供了一种可靠的方法。

在PerkinElmer LabChip GXII Touch微流控毛细管蛋白质分析系统上使用ProteinEXact检测方法,可以实现灵敏度高、重复性好的蛋白质定量和分子量检测。非常适合于对检测精度有较高要求的生物制药上下游样品分析,以及和基因治疗样品的高分辨率、可对AAV属性进行重复性、高通量的表征。此外,该方法还可以用于双特异性抗体表征分析,这个应用我们下一期再来继续聊。

 

PerkinElmer LabChip GXII Touch系统特点

  • 标准化、高质量的数字数据,重现性好
  • 快速高效:1分钟以内,比普通CE快45-70倍
  • 可应用于多个环节:表达体系/条件的筛选、纯化过程的优化、剂型、生产过程及产品放行
  • 可提供多方面的定量数据:浓度、纯度、糖型、聚集体、电荷异质性等等
  • 符合相关法规要求
  • 领域内的权威用户已采用并给予高度评价

 

ProteinEXact芯片和试剂盒特点

  • 芯片可重复使用
  • 最低上样量2uL
  • 片段大小准确性高:<2%
  • 片段大小分辨率高:±10%分子量差异
  • 灵敏度高:0.2ng/μL
  • 样品分析时间短:65 sec

 

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