实现免疫细胞高效基因转导的三个步骤

时间：2021-10-28 来源：上海玮驰仪器有限公司阅读：700

图1：免疫系统细胞分化图

Boosting the Immune System–

Steps to Take for Successful Substrate Delivery

嵌合抗原受体表达细胞的产生和基于CRISPR/Cas9的基因组编辑等新技术的建立，为改善或增强免疫应答提供了简便易行的方案。然而，将底物输送到我们的目的细胞中是必不可少的-不仅要注重高转染效率，而且要注重细胞活性、功能性的保存以及患者的健康和安全。此外，传递方法在底物方面应该是灵活的，因为编辑细胞基因组的研究人员不仅依赖于质粒DNA的成功转染，还依赖于RNA和/或蛋白质的成功转染^[1]。

到目前为止，原代免疫细胞的转染是具有挑战性的。特别是大家感兴趣的细胞类型，如T淋巴细胞、自然杀伤细胞和B细胞，用经典的基于试剂的方法很难转染^[2]。使用转染试剂的主要问题是转染效率低、细胞毒性和免疫原性。后者在免疫治疗方面是不利的，因为细胞应该维持它们在免疫系统中的功能，而不是被转染方式预先激活。

实现合理转染效率的替代方法是病毒转导，但病毒生产耗时且成本高，另一种方案是改进的电穿孔技术，如Nucleofector^TM技术，作为一种物理的方法，它只需要很低的生物安全预防措施(表1)。

表1：不同底物输送给原代免疫细胞的优缺点综述

实现免疫细胞

高效基因转导的三个步骤

步骤1-选择合适的转染方法

通过病毒转导，可以将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。常用的是慢病毒载体，慢病毒载体尚不能将目的基因插入到特定位点而是随机插入。

一种将底物递送到人体免疫细胞的便捷技术是Nucleofector^TM技术，这是一种改进的电穿孔技术。专用的Nucleofector^TM解决方案与针对特定细胞类型优化的电转参数相结合，使研究人员能够实现高转染效率和良好的存活率。底物直接输送到细胞质和细胞核。小化的免疫原性保留了免疫细胞的功能(图2)。

图2：Nucleofection后的细胞功能。条形图显示了小鼠树突状细胞、人类巨噬细胞和人类T细胞在Nucleofection后的相对功能(样本)。功能以与未转染对照(对照)相关的百分比表示。用小鼠树突状细胞的IL-6特异性ELISA、人巨噬细胞的TNF-a特异性ELISA、刺激的人T细胞的IFN-g特异性ELISA和CD25特异性抗体(静息状态和刺激状态)流式细胞仪进行功能分析。实验是在标准的Nucleofector^TM设备(小鼠树突状细胞)或96孔Shuttle^TM系统(人巨噬细胞和人T细胞)上进行的。^[3]

Nucleofector^TM技术不仅保证了效率和可行性。考虑到表达CAR的T细胞^[4]和NK细胞^[5]以及基因组编辑^[6]，不同底物的共转染也是可以简单的实现-在大小和底物类型上具有很大的灵活性，如DNA、RNA和蛋白质。

通过使用4D-Nucleofector^TM技术，实现封闭和可扩展的转染应用。它可以很容易地从用于基础研究或筛选目的的20-100ul小规模体系到高达20ml的后续应用，例如用于细胞治疗的体外修饰。

步骤2-让你的免疫细胞循规蹈矩

不管底物递送的方法是什么，免疫细胞在转染前的状态决定了之后细胞的活性和功能。细胞对转染过程的反应有多强烈或敏感，一方面取决于分离过程，另一方面也存在供体特性的问题。

能够获得血液或骨髓样本以自我分离免疫细胞的研究人员，应确保遵守既定的分离、刺激免疫细胞的标准操作程序。严格按照说明操作将产生可比较和可重现的结果。

如果无法获得这种来源，研究人员就会利用商业上可获得的造血细胞和免疫细胞进行研究。这有利于在质量控制和优化培养系统方面的工作。

然而，无论细胞的来源是什么，原代细胞都是来自单个有机体的细胞。捐赠者特定的差异是不可避免的，并将导致结果差异^[7]。

步骤3-准备好稳定的底物递送

对于病毒转导来说，病毒颗粒的制备是复杂的，而用于改良电穿孔的底物选择则更加多样化。

为了确保佳的条件，底物应该是高质量的。当我们选择质粒DNA进行基因递送时，有许多需要考虑的方面，关于载体DNA的信息可以在Lonza Important Vector Factors for Gene Expression Technical Reference Guide中找到。

底物的大小和浓度是这个游戏中的额外玩家。底物大小本身通常不是影响转染效率的主要因素，但当质粒大小超过约15kb时，效率会有所下降。因此，在转染较大的质粒时更要考虑实验所需的DNA量和质粒的完整性。增加每个反应的DNA含量通常会提高转染效率，但由于高浓度的DNA可能会对细胞产生毒性，细胞存活率可能会降低。对于Nucleofection实验，推荐的底物浓度通常在2-5ug/100ul(DNA)、2 nM-2uM(siRNA)和10-20ug/100ul(mRNA)之间。

关于推荐的Nucleofection条件，请在图一找到找到免疫系统细胞分化的图表(图1)。下面的表2总结了大多数这些细胞的转染条件以及4D-Nucleofector^TM系统的参考文献。

表2：人类原代免疫细胞Nucleofection条件、结果和参考文献(OP：optimized protocol可用的优化方案，IHD：in-house data基于内部数据)

龙沙致力于支持您对免疫系统的研究，这就是我们提供 Nucleofector^TM 技术和相应的 Nucleofector^TM 试剂盒以高效转染免疫细胞的原因。此外，我们还提供来自各种不同供体的造血和免疫细胞。

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Lonza.com/new-4D-Nucleofector

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4D-Nucleofector^TM X Unit ——适用于 100 µL 比色皿或 20 µL 16 孔试管中的各种细胞数量

4D-Nucleofector^TM Y Unit ——用于转染 24 孔培养板的贴壁细胞

4D-Nucleofector^TM LV Unit ——用于封闭、可扩展的大容量转染多达1x10⁹ 个细胞

4D-Nucleofector^TM 96 孔装置——一次同时转染多达96 个样品

Selected References:

1 ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering

2 Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques

3 Nucleofection – Combining High Transfection Performance with Superior Preservation of Functionality

4 A new approach to gene therapy using Sleeping Beauty to genetically modify clinical-grade T cells to target CD19

5 Genetic manipulation of NK cells for cancer immunotherapy: Techniques and clinical implications

6 A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors

7 Human immune system variation

8 Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells

9 Alterations in Cholesterol Metabolism Restrict HIV-1 Trans Infection in Nonprogressors

10 Altered expression of miR-181a and miR-146a does not change the expression of surface NCRs in human NK cells

11 Hyperactive piggyBac Gene Transfer in Human Cells and In Vivo

12 Characterization of Programmed Death-1 Homologue-1 (PD-1H) Expression and Function in normal and HIV Infected Individuals

13 IL-27 inhibits HIV-1 infection in human macrophages by down-regulating host factor SPTBN1 during monocyte to macrophage differentiation

14 Generation of multivirus-specific T cells to prevent/treat viral infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant

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