瑞孚迪LabChip GX应用于cfDNA测序研究助力NIPT检测方法优化

游离DNA (cell free DNA，cfDNA)，是一种在细胞外呈现游离状态的DNA片段，广泛存在于人类血浆、脑脊液、尿液、胸水、腹水或粪便中。健康人外周血中cfDNA浓度大都小于100 ng/ml，平均值约为30 ng/ml。在疾病状态下(例如：肿瘤、术后、病毒感染、心血管疾病等) cfDNA水平可见升高。cfDNA研究可用于筛选液体活检和其他临床研究应用的生物标志物，因此，受到广泛的关注。血浆cfDNA研究促进了无创胎儿产前诊断(NIPT)检测技术的发展，cfDNA检测的优势包括非侵入性、风险低、准确率高。因此，cfDNA在妊娠或临床疾病的早期诊断、预后、监测等方面具有巨大的潜在应用价值。

一，2018年3月1日，法国巴黎Cerba实验室等多家单位的联合研究成果发表于GENETICS in MEDICINE期刊（影响因子8.822），题目为“Cell-free fetal DNA versus maternal serum screening for trisomy 21 in pregnant women with and without assisted reproduction technology: a prospective interventional study”。这是一项前瞻性的干预研究，为筛查胎儿21三体综合征的发病情况，科学家对自然受孕(SP)或采用辅助生殖技术(ART)受孕的孕妇开展了细胞游离DNA(cfDNA)测序和孕妇血清筛查(MSS)。

研究背景：cfDNA作为一项初步筛选试验已经使用了若干年，但很少有研究以前瞻性的方式探讨这一选择。有报道称，MSS项目对于借助ART的妊娠其检测准确性低于SP，因此，这个问题值得大家关注。

研究方法：开展此项前瞻性介入研究旨在探讨cfDNA与MSS在有或没有ART的妊娠中的表现。每位志愿者均接受MSS和cfDNA检测，以开展胎儿21三体综合征的筛查。初步分析队列共有794例志愿者，其中SP组志愿者472例，抗逆转录病毒治疗后的妊娠志愿者322例。该研究中采用瑞孚迪的LabChip GX核酸分析仪对cfDNA测序文库进行质控分析。

研究结果：对采用2种方法检测胎儿21三体综合征的筛查结果进行比较，MSS的假阳性率和阳性预测值分别为6.6%和8.8%，而cfDNA的分别为0%和100%。ART组的MSS假阳性率和阳性预测值分别为11.7%和2.6%，SP组的分别为3.2%和21.1%。使用cfDNA检测时，全球侵入性手术的发生率为1.9%（15/794），而如果单独使用MSS，则为8.4%（65/794）。

表1. MMS和cfDNA对于SP组和ART妊娠组的21三体综合征的检测性能比较

本文结论：总体而言，胎儿21三体综合征的筛查结果说明了使用cfDNA对21三体综合征的筛查性能明显优于MSS。cfDNA在SP和ART妊娠中的检测性能均优于MSS，从而减少了侵入性手术的数量。该研究结果提示cfDNA应考虑作为临床初级筛查手段，特别是在抗逆转录病毒治疗后获得的妊娠筛查中。

二，2018年3月12日，法国Life&Soft、AP-HP和CERBA实验室的合作研究成果发表于Scientific Reports期刊（影响因子4.379），题目为“Using massively parallel shotgun sequencing of maternal plasmatic cell-free DNA for cytomegalovirus DNA detection during pregnancy: a proof of concept study”。这是一项概念验证性研究，通过对母体血浆cfDNA的大规模平行测序进行巨细胞病毒(HCMV)的DNA检测。

研究背景：孕妇感染HCMV会导致胎儿的先天性感染，从而对新生儿的健康产生严重影响。研究表明，每毫升血浆中有1000~1000亿个DNA片段处于无细胞的循环状态。目前，此类DNA的研究已经扩展到了NIPT应用领域中。

研究方法：对27例阳性校准样本和58例阴性血浆cfDNA样本进行鸟枪法测序(MPSS)检测，分析测序深度与病毒载量的相关性。随后，在人群队列中进行HCMV病毒检测的验证分析，此队列包含538例妊娠女性，其中有36例进行了2次测序，因此共计574个孕妇血浆cfDNA数据。

该研究中采用PerkinElmer的LabChip GX核酸分析仪对cfDNA测序文库进行质控分析。

研究结果：此项研究证明可以在大规模并行鸟枪法测序的NIPT数据中检测到病毒的特异性读取。此外，校准样本的病毒载量与参考基因组上比对的reads数量之间有很强的相关性。基于以上的分析结果，研究团队构建了一个统计模型，能够量化患者样本的病毒载量。

图1. 孕妇队列的HCMV测序结果回顾

(A) 538个血浆样本的原始测序结果总结；(B) 538个血浆样本中潜藏HCMV样本的平均深度；(C) 对阳性样本进行reads的详细比对。

研究结论：建议使用这种新方法来检测和量化妊娠期间循环的DNA病毒(如：HCMV)，该方法可用于提高NIPT的诊断水平。

参考文献：

1. Costa JM, Letourneau A, Favre R, et al. Cell-free fetal DNA versus maternal serum screening for trisomy 21 in pregnant women with and without assisted reproduction technology: a prospective interventional study. Genet Med. 2018, 20(11):1346-1353. doi: 10.1038/gim.2018.4.

2. Chesnais V, Ott A, Chaplais E, et al. Using massively parallel shotgun sequencing of maternal plasmatic cell-free DNA for cytomegalovirus DNA detection during pregnancy: a proof of concept study. Sci Rep. 2018, 8(1):4321. doi: 10.1038/s41598-018-22414-6.

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