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内毒素面前,鲎试剂的前世今生

时间:2020-11-05 来源:上海玮驰仪器有限公司 阅读:2234

像弗莱明发现青霉素一样,鲎和内毒素次碰撞源于科学家Frederik Bang的一只被弧菌感染的美洲鲎。Frederik Bang当时正孜孜不倦地研究着鲎的血液循环,这只不幸感染的美洲鲎死时血液几近半凝固状态,这一奇特现象点燃了Bang的求知内心。

 

几经验证,Bang和助手Jack Levin终发现鲎的血液细胞或者变形细胞内含有一种凝固剂,当存在革兰氏阴性细菌时就能形成凝胶。两人随即意识到这种凝胶反应可以作为检验热源物质的"fire alarm"——报警系统。

 

科学家Frederik Bang
 

1977年,美国食品和药物管理局(FDA)开始允许制药公司用鲎试剂(LAL)替换低效而繁琐的兔子毒素测试试验。

兔子热源检测,费时而昂贵;鲎试剂凝胶法,更经济快速 (图片来源于百度百科)

 

同时,基于鲎试剂人们开发出各种不同的方法,每种方法都有其独特的特点。例如,凝胶法鲎试验(PYROGENT™) 提供了一种简单的阳性/阴性结果,大多数药典专论将其作为官方仲裁试验。

 

如下图所示,样品经多次稀释后加入鲎试剂,在水浴锅中孵育1h,翻转180°后,看凝胶是否滑落来判断是否有内毒素。该方法不需要复杂的设备,水浴锅即可,但水浴锅本身是潜在的污染源,而且需要定期换水,使用上并不方便。另外,样品量比较多时会带来较大的人力负担。

 

鲎试剂凝胶法检测原理图示

图片来源:https://kepleybiosystems.com/hcrbi

 

再者,就是定量法。定量法可以借助于光吸收酶标仪设备,读取样品与鲎试剂作用后吸光值的变化,通过标准曲线,计算出样品内毒素的含量,以量来评估是否可以放行。相比凝胶法会更准确;其次,样品量比较大时,在多孔板上设置好对照组和样品组,让设备自行运行后分析出结果即可。从长期来看,比较节省人力成本,减少人力负担。

 

定量法又可细分为动态浊度法(PYROGENT™-5000)和动态显色法(Kinetic-QCL™)。

 

动态浊度法分析检测

PYROGENTTM-5000 Kinetic Turbidimetric LAL Assay

 

这些方法具有更小的样品干扰,当面临不同的生物制品,比如疫苗制品,新冠疫苗,狂犬疫苗,基因和细胞治疗制剂,mAb等时,检测准确性和灵敏性更高,检测限可以低至0.005EU/mL。目前,中国药典(NMPA)、FDA、美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、日本药典(JP)接受所有上述鲎试验方法。

 

不同区域的鲎存在显著差异性,比如东方鲎和美洲鲎个头差异就很大。批次间的稳定性也会因鲎的个体差异性而不同。

 

目前市场上有多种国产和进口鲎试剂品牌,国产鲎试剂在价格上有竞争优势,进口鲎试剂在国际市场上更受认可。选择什么样的鲎试剂和后期临床前申报是息息相关的。从市场反馈来看,若需在不同国家获取申报资格,多会选择在国际上更受认可的品牌,比如 Lonza 的内毒素检测试剂盒。

 

鲎的个体差异性

图片来源:https://kepleybiosystems.com/hcrbi

 

鲎的历史可以追溯至古生代的泥盆纪,那时,恐龙尚未出现,原始鱼类刚刚问世。然而,自从鲎被用来开发检测内毒素之后,世界各地均出现疯狂捕捞过度开采的现象。就我国而言,因索取无度,才20余年我国沿海的鲎已从遍布海滩到几乎迹。

 

鲎采血现场

图片来源:Timothy Fadek / Corbis / Getty

 

幸运的是,能够取代鲎试剂的检测方法已经问世。Lonza科学家开发了PyroGene™重组表达的C因子检测方法。C因子是内毒素激活的鲎凝固级联反应中的个组成部分,只用于内毒素检测,是进行内毒素释放测试的可靠替代方案。

 

LAL和重组C因子检测的原理示意图

 

重组C因子是一种化学合成的试剂,性状更稳定,均一性相对也更好。试剂价格目前和鲎试剂相当,后期如在国内外广泛应用起来,价格会比鲎试剂更具竞争优势。

重组C因子检测试剂盒

 

 

目前,FDA现已批准重组C因子作为鲎试剂的替代方案,用于生物制品的放行和过程检测。2020版中国药典通则9301附录里面也有关于重组C因子的检测说明,但是如需放行检测,还需要做相关验证试验。

 

内毒素检测只是生物制剂质量控制的冰山一角,然而这一角冰山却足以毁灭一个物种。正如更多更好的药物可以造福更多的人,对环境更友善的检测方法也能造福更多的“小鲎小虾”。