IP-One Gq kit，你值得拥有！

来源:瑞孚迪生命科学

作者：Tyki

G蛋白偶联受体（G Protein Coupled Receptors, GPCRs）是真核生物中最大且最多样的膜蛋白受体，多达三分之一的市售药物通过与GPCR结合发挥作用，靶向GPCR的疗法包括激动剂、拮抗剂、反向激动剂、变构调节剂等，用于治疗包括糖尿病、心脏病、肿瘤、免疫病、精神疾病等多个领域的疾病，是目前最具治疗前景的一类药物靶点。

2022年德国埃尔朗根-纽伦堡大学Peter Gmeiner教授于Science杂志上发表题为“Structure-based discovery of nonopioid analgesics acting through the α2A-adrenergic receptor”论文，该研究发现了靶向α2A肾上腺素受体的新型小分子激动剂，新化合物具有与阿片类药物吗啡相似的镇痛效果，但没有抑制呼吸和成瘾等不良反应，从而有可能在疼痛治疗中得到更广泛使

Fig. 1. Newly discovered a2AAR agonists from ultralarge library docking.

研究人员在3亿多个虚拟分子的文库中进行筛选，经过一系列复杂的结合位点虚拟对接模拟，选择了48种化合物进行从头合成并测试，其中功能性筛选研究人员采用了HTRF IP-ONE Gq Kit（如Figure 2），最终筛选到两个符合标准的化合物，新化合物作为激动剂可与α2A肾上腺素受体结合，并仅激活特定的G蛋白通路；后续的动物实验结果表明，这些激动剂可以在动物大脑中达到有效浓度，帮助动物缓解多种形式的疼痛，并且不会引起镇静。

Figure 2. Functional data for docking hits against a2AAR. (A,B) Gi signaling for docking hits against human a2AAR in the IP-One assay.

科学家为什么选择HTRF IP-ONE检测？

Gq通路是G蛋白介导的信号传导通路之一，其效应分子为磷脂酶C（PLC），当细胞外的信号分子与Gq受体结合后，激活细胞膜上的PLC，水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）为肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3与滑面内质网和线粒体上的受体结合，钙通道活化，引起细胞内钙离子浓度升高（如Figure 3所示）。目前Gq通路检测主要有两种途径，分别测定细胞内Ca2+浓度或IP1含量的变化。

钙离子检测主要通过钙离子敏感荧光探针检测细胞内的钙释放；而IP1是IP3的转化产物之一， IP3的半衰期很短，其产生后在磷酸酶的作用下生成IP2，然后生成IP1，终产物为myo-肌醇。LiCl能够阻止IP1转化为myo-肌醇，当细胞内加入一定浓度的LiCl，可引起IP1的积聚。所以通过测定IP1的含量，可以用于评估Gq通路的活化程度。

Figure.3

IP-ONE检测的优势

1特异性更好，假阳性率更低

IP1仅由磷脂酶 (PLC) 作用产生，信号特异于Gq通路，而钙反应本质上是复杂的，钙离子的释放经常由非G蛋白机制触发（如Ca2+渗透通道、Ca2+泵和Ca2+转运蛋白），与这些受体结合的化合物被认为是“脱靶”的 (如Figure 4所示)。当有Ca2+载体和透化细胞膜相关的化合物用于激动剂筛选时，钙离子检测容易出现假阳性结果，而IP1可确保这些化合物不被检测到。

Figure.4

与钙离子检测相比，IP1的假阳性率更低，无需对初筛获得的Hit进行反复筛选，减少额外工作和成本。如Figure 5所示，钙离子检测的高假阳性率会导致对药物筛选的错误评估，从而夸大命中率，而IP-One几乎只有特定命中，假阳性率极低。

Figure.5 Rochdi Bouhelal presentation at SBS 2005 – Novartis Institutes for BioMedical Research.

2IP1基于累积测定，更加准确

钙离子变化涉及多种信号通路，呈现瞬态和高度调节，是非平衡检测，钙离子检测会导致筛选结果存在偏差，出现假阴性，从而导致重要分子的丢失；而IP1的累积与刺激时间成正比关系，可记录每一个可能的Hit，包括慢效化合物。

Figure.6

3IP1检测提供高“Z”值，更适合高通量筛选(HTS)

“Z”值是高通量筛选中测定稳健性的参数。下面案例研究中，IP1检测证明了卓越的检测质量，在每次运行中都能提供高稳健的“Z”值 (~0.78)。

Figure. 7 Liu K (2008), Curr Chem Genomics. Comparison on Functional Assays for Gq-Coupled GPCRs by Measuring Inositol Monophospate-1 and Intracellular Calcium in 1536-Well Plate Format.

4稳定性：信号稳定性是 HTS成功的关键

不稳定的信号意味着必须在添加试剂后立即读取板，这可能会降低通量。HTRF信号以及标准曲线测定窗口随着时间的推移保持稳定，表现出相同的性能。凭借稳定的信号，HTRF IP1检测可以防止可能出现的不可预见问题。

GPCR检测平台

此外还有Phosphorylation assays，Cell-based Receptor binding assays - Tag-lite等，如果您感兴趣的话，请联系我们吧！

来源:瑞孚迪生命科学

作者：Tyki

G蛋白偶联受体（G Protein Coupled Receptors, GPCRs）是真核生物中最大且最多样的膜蛋白受体，多达三分之一的市售药物通过与GPCR结合发挥作用，靶向GPCR的疗法包括激动剂、拮抗剂、反向激动剂、变构调节剂等，用于治疗包括糖尿病、心脏病、肿瘤、免疫病、精神疾病等多个领域的疾病，是目前最具治疗前景的一类药物靶点。

2022年德国埃尔朗根-纽伦堡大学Peter Gmeiner教授于Science杂志上发表题为“Structure-based discovery of nonopioid analgesics acting through the α2A-adrenergic receptor”论文，该研究发现了靶向α2A肾上腺素受体的新型小分子激动剂，新化合物具有与阿片类药物吗啡相似的镇痛效果，但没有抑制呼吸和成瘾等不良反应，从而有可能在疼痛治疗中得到更广泛使

Fig. 1. Newly discovered a2AAR agonists from ultralarge library docking.

研究人员在3亿多个虚拟分子的文库中进行筛选，经过一系列复杂的结合位点虚拟对接模拟，选择了48种化合物进行从头合成并测试，其中功能性筛选研究人员采用了HTRF IP-ONE Gq Kit（如Figure 2），最终筛选到两个符合标准的化合物，新化合物作为激动剂可与α2A肾上腺素受体结合，并仅激活特定的G蛋白通路；后续的动物实验结果表明，这些激动剂可以在动物大脑中达到有效浓度，帮助动物缓解多种形式的疼痛，并且不会引起镇静。

Figure 2. Functional data for docking hits against a2AAR. (A,B) Gi signaling for docking hits against human a2AAR in the IP-One assay.

科学家为什么选择HTRF IP-ONE检测？

Gq通路是G蛋白介导的信号传导通路之一，其效应分子为磷脂酶C（PLC），当细胞外的信号分子与Gq受体结合后，激活细胞膜上的PLC，水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）为肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3与滑面内质网和线粒体上的受体结合，钙通道活化，引起细胞内钙离子浓度升高（如Figure 3所示）。目前Gq通路检测主要有两种途径，分别测定细胞内Ca2+浓度或IP1含量的变化。

钙离子检测主要通过钙离子敏感荧光探针检测细胞内的钙释放；而IP1是IP3的转化产物之一， IP3的半衰期很短，其产生后在磷酸酶的作用下生成IP2，然后生成IP1，终产物为myo-肌醇。LiCl能够阻止IP1转化为myo-肌醇，当细胞内加入一定浓度的LiCl，可引起IP1的积聚。所以通过测定IP1的含量，可以用于评估Gq通路的活化程度。

Figure.3

IP-ONE检测的优势

1特异性更好，假阳性率更低

IP1仅由磷脂酶 (PLC) 作用产生，信号特异于Gq通路，而钙反应本质上是复杂的，钙离子的释放经常由非G蛋白机制触发（如Ca2+渗透通道、Ca2+泵和Ca2+转运蛋白），与这些受体结合的化合物被认为是“脱靶”的 (如Figure 4所示)。当有Ca2+载体和透化细胞膜相关的化合物用于激动剂筛选时，钙离子检测容易出现假阳性结果，而IP1可确保这些化合物不被检测到。

Figure.4

与钙离子检测相比，IP1的假阳性率更低，无需对初筛获得的Hit进行反复筛选，减少额外工作和成本。如Figure 5所示，钙离子检测的高假阳性率会导致对药物筛选的错误评估，从而夸大命中率，而IP-One几乎只有特定命中，假阳性率极低。

Figure.5 Rochdi Bouhelal presentation at SBS 2005 – Novartis Institutes for BioMedical Research.

2IP1基于累积测定，更加准确

钙离子变化涉及多种信号通路，呈现瞬态和高度调节，是非平衡检测，钙离子检测会导致筛选结果存在偏差，出现假阴性，从而导致重要分子的丢失；而IP1的累积与刺激时间成正比关系，可记录每一个可能的Hit，包括慢效化合物。

Figure.6

3IP1检测提供高“Z”值，更适合高通量筛选(HTS)

“Z”值是高通量筛选中测定稳健性的参数。下面案例研究中，IP1检测证明了卓越的检测质量，在每次运行中都能提供高稳健的“Z”值 (~0.78)。

Figure. 7 Liu K (2008), Curr Chem Genomics. Comparison on Functional Assays for Gq-Coupled GPCRs by Measuring Inositol Monophospate-1 and Intracellular Calcium in 1536-Well Plate Format.

4稳定性：信号稳定性是 HTS成功的关键

不稳定的信号意味着必须在添加试剂后立即读取板，这可能会降低通量。HTRF信号以及标准曲线测定窗口随着时间的推移保持稳定，表现出相同的性能。凭借稳定的信号，HTRF IP1检测可以防止可能出现的不可预见问题。

GPCR检测平台

此外还有Phosphorylation assays，Cell-based Receptor binding assays - Tag-lite等，如果您感兴趣的话，请联系我们吧！